10.3 Pharmakologische Testung

10.3.1 CDK-Testsysteme

Die CDK-inhibitorische Aktivität der dargestellten Verbindungen wurde durch die quantitative Bestimmung der durch CDK katalysierten Phosphorylierung von Histon H1 bestimmt. Diese Testung wurde im Arbeitskreis von Laurent Meijer (CNRS, Station Biologique, Roscoff, Frankreich) durchgeführt. Gemessen wurde die Inkorporierung von radioaktiv markiertem Phosphat in Histon H1.

Zur Berechnung der Konzentration eines Inhibitors, die eine 50-prozentige Enzymhemmung (IC50) hervorruft, wurden Dosis-Wirkungs-Kurven von jeder Testsubstanz für die Inhibition des CDK1/Cyclin B-, des CDK5/p35- bzw. CDK5/p25-Komplexes aufgestellt.

CDK1/Cyclin B-Testsystem7,11,120

Durch Affinitätschromatographie an p9CKShs1-Sepharose-Kügelchen wird CDK1/Cyclin B aus in der M-Phase befindlichen Oocyten des Seesterns Marthasterias glacialis isoliert. Anschließend wird mit freiem p9CKShs1 eluiert.
In der Testmischung sind bei 30 μl Endvolumen folgende Bestandteile enthalten: 0.5-1 μl gereinigtes Enzym, 5 μl Histon H1 (5 mg/ml), 5 μl [γ-32P]ATP (15 μM, 3000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) und 3 μl des Inhibitors (0.1 1 000 μM) in Puffer C [60 mM β Glycerolphosphat, 15 mM p Nitrophenyl-phosphat, 25 mM 3 (N-Morpholino)-propansulfonsäure (Mops, pH 7.2), 5 mM Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-Tetraessigsäure (EGTA), 15 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Natriumvanadat, 1 mM Phenylphosphat, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 100 μmol Benzamidin].

Zur Bestimmung der maximalen Phosphorylierungsrate wird Puffer C anstelle der Testsubstanz eingesetzt. In Abwesenheit von Histon H1 in der Testmischung wird die nichtspezifische Bindung bestimmt, welche von jedem Volumen abgezogen wird. Die jeweilige Testung beginnt mit der Zugabe von radioaktivem ATP. Nach 10 Minuten Inkubation bei 30 °C werden 25 μl des Flüssigkeitsüberstandes auf Whatman P81 Phosphocellulose-Papier (2.5 x 3.0 cm) getupft. Die Filter werden nach 20 Sekunden für je 5 Minuten mit einer Lösung aus 10 ml Phosphorsäure in je 1 l Wasser gewaschen und in nassem Zustand in 1 ml ACS Szintillationsmischung (Amersham) überführt. Die 32P-Radioaktivität wird durch einen Packard Tri-Carb-Zähler bestimmt. Da die Testsubstanz in DMSO als 100 mM Stammlösung gelöst ist, werden Kontrollanalysen durch Verwendung entsprechender DMSO-Verdünnungen durchgeführt, wobei die DMSO-Konzentration in der Reaktionsmischung nie höher als 1 % ist.

Die Kinase-Aktivität wird als molare Menge der Phosphatgruppen, die nach 10 Minuten Inkubation in Histon H1 aufgenommen werden, oder in % der maximalen Kinase-Aktivität bestimmt. Alle Tests erfolgen als Dreifachbestimmungen.7,11

Zur Berechnung der Konzentration eines Inhibitors, die eine 50-prozentige Enzymhemmung (IC50) hervorruft, wurden Dosis-Wirkungs-Kurven von jeder Testsubstanz für die Inhibition des CDK1/Cyclin B-Komplexes aufgestellt.

CDK5/p35-Testsystem und CDK5/p25-Testsystem7,11,120

CDK5/p35 wird aus Rinderhirn gewonnen. Die Reinigung erfolgt wie in der Literatur angegeben.121 Nach Vereinigung der aktiven Fraktionen der Superose 12-Säule wird eingeengt bis eine ungefähre Endkonzentration von 25 μg Enzym/ml vorliegt. Die Aktivität wird wie für den CDK1/Cyclin B-Komplex beschrieben bestimmt. Hierbei wird die Kinase mit 1 mg/ml Histon H1 und 15 μM [γ-32P]ATP versetzt bei einer Inkubationszeit von 10 Minuten und einem Endvolumen der Testmischung von 30 μl.

Der CDK5/p25-Komplex wurde hergestellt durch Mischen äquivalenter Mengen an rekombinanter Säugetier-CDK5 und p25, die in Escherichia coli exprimiert wurden. Die Aktivität wird in Puffer C bestimmt, wie es für CDK1/Cyclin beschrieben wurde.7

10.3.2 GSK-3β-Testsystem

Die Aktivität der dargestellten Verbindungen bei GSK-3β wurde durch die quantitative Bestimmung der durch GSK-3β katalysierten Phosphorylierung des GS-1Peptids bestimmt. Diese Testung wurde ebenfalls im Arbeitskreis von Laurent Meijer (CNRS, Station Biologique, Roscoff, Frankreich) durchgeführt. Gemessen wurde die Inkorporierung von radioaktiv markiertem Phosphat in das GS-1-Peptid. 7,11

GSK-3β wird in Sf9 Insektenzellen exprimiert und daraus isoliert. Die Testung erfolgt nach 1/100 Verdünnung in 1 mg/ml BSA (bovine serum albumin), 10 mM Dithiothreitol, mit 5 μl des GS-1-Peptids als Substrat (40 μM) in der Gegenwart von 15 μM [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol, 1 mCi/ml) in Puffer A (10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Dithiothreitol, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 μg/ml Heparin). Als Endvolumen werden 30 μl erhalten. Nach 30 Minuten Inkubation bei 30 °C werden 25 μl des Flüssigkeitsüberstandes auf Whatman P81 Phosphocellulose-Papier (2.5 x 3.0 cm) getupft. Die Filter werden nach 20 Sekunden für je 5 Minuten mit einer Lösung aus 10 ml Phosphorsäure pro 1 l Wasser gewaschen und in nassem Zustand in 1 ml ACS Szintillationsmischung (Amersham) überführt. Die 32P-Radioaktivität wird durch einen Packard Tri-Carb-Zähler bestimmt. Da die Testsubstanz in DMSO gelöst ist, werden Kontrollanalysen durch Verwendung entsprechender DMSO-Verdünnungen durchgeführt.

Zur Berechnung der Konzentration eines Inhibitors, die eine 50-prozentige Enzymhemmung (IC50) hervorruft, wurden Dosis-Wirkungs-Kurven von jeder Testsubstanz für die Inhibition der GSK-3β aufgestellt.

10.3.3 In vitro Tumorzelllinien-Screening des NCI (NCI Human Tumor Cell Line Anti-Cancer Drug Screen)

Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Paullonderivate und einige Vorstufen wurden neben der Testung an isolierten Enzymen ebenfalls einer Untersuchung bezüglich ihrer Antitumoraktivität gegen Zelllinien unterzogen. Diese Tests wurden vom National Cancer Institute (in Bethesda, USA) im Rahmen eines in vitro Screening Programms durchgeführt. In der Literatur sind genauere Angaben zu finden.107-110

Im Rahmen des Screenings werden die entsprechenden Substanzen an sechzig menschlichen Tumorzelllinien getestet. Die Zelllinien leiten sich von insgesamt neun verschiedenen Krebsarten ab: Neben Brust-, Prostata-, Nieren-, Eierstock-, Darm- und Lungenkrebs sind Leukämie, Melanom und Krebs des Zentralen Nervensystems vertreten.

Bei den Untersuchungen werden die Tumorzellen in den Kavitäten von Mikrotiterplatten mit der Testsubstanz inkubiert. Es werden jeweils fünf verschiedene Konzentrationen zwischen 10-8 M und 10-4 M verwendet.

Das Medium wird nach 48 Stunden entfernt. Die Zellen werden gewaschen und fixiert. Durch den Farbstoff Sulforhodamin B, welcher an basischen Aminosäuren bindet, kann der solubilisierte Rückstand in den Kavitäten so angefärbt werden, dass eine spektrophotometrische Messung die Bestimmung der Zellmasse erlaubt. Aus dieser lässt sich das prozentuale Wachstum der Zellen bestimmen.

Aus den Daten wurden für die hier beschriebenen Verbindungen für jede Zelllinie Dosis-Wirkungs-Kurven ermittelt. Die entsprechenden Aktivitäten werden durch die dekadischen Logarithmen der molaren Testzubstanz¬konzentrationen angegeben, und zwar für die jeweilige Konzentration, die eine 50-prozentige Wachstumshemmung (GI50), eine totale Wachstumshemmung (TGI) und ein Absterben der Hälfte der Tumorzellen (LC50) bewirkten. Für die GI50, die TGI und die LC50 wurden vom NCI die entsprechenden Mittelwerte der log10-Werte aller getesteten Zelllinien berechnet und als sogenannter Meangraph Midpoint (MG_MID) angegeben. Der MG_MID beschreibt die durchschnittliche Aktivität einer Substanz gegenüber der Gesamtheit der Tumorzelllinien.

Die Testergebnisse werden für jede Testsubstanz in Form eines Balkendiagramms aufgestellt, welches die relative Empfindlichkeit einer einzelnen Zelllinie im Vergleich zu dem entsprechenden MG_MID-Wert veranschaulicht. Das folgende Bild 10-1 zeigt als Beispiel das Balkendiagramm von Verbindung 154. Die Balkendiagramme der drei Parameter (GI50, TGI, LC50) enthalten als zentrale Achsen den ihnen zugehörigen Meangraph Midpoint-Wert. Balken nach rechts kennzeichnen Zelllinien, die empfindlicher reagieren als der Durchschnitt. Ein Balken nach links bedeuten eine verminderte Empfindlichkeit der entsprechenden Zelllinie verglichen mit dem Durchschnitt. Die Balkenlänge ist proportional zur relativen Empfindlichkeit der Zelllinie im Vergleich zum MG_MID. Die Angabe der Werte erfolgt logarithmisch, weshalb eine um 1 erhöhte Empfindlichkeit eine Hemmung der Zelllinie durch eine zehnfach niedrigere Konzentration der Testsubstanz bedeutet als durch den MG_MID beschrieben wird. Die Verbindung 154 weist z.B. eine Selektivität für die Leukämie-Zelllinie SR für die ersten beiden Parameter auf, wie im Bild 10-1 zu erkennen ist.

Die Balkendiagramme einer Testsubstanz ergeben ein Profil welches auch als „Fingerprint“ bezeichnet wird. Dieses Muster kann mithilfe des COMPARE-Algorithmus109 ausgewertet werden, wobei Selektivitätsprofile verschiedener Verbindungen verglichen werden. Zeigt sich eine hohe Korrelation, so lässt sich für die entsprechenden Testsubstanzen ein gemeinsamer Wirkmechanismus postulieren.

Bild 10-1
Bild 10-1: Balkendiagramm von Verbindung 154