2.3 Aufbau, Aktivierung und Inaktivierung der CDK

Insgesamt existieren in einer Zelle vielfältige Möglichkeiten zur Kontrolle der CDK-Aktivität, so dass sich eine große regulatorische Flexibilität in Bezug auf den Zellzyklus ergibt.

Die CDK-Aktivität kann durch folgende Mechanismen gesteuert werden:12,26-29

Bild 2-2
Bild 2-2: Regulation der CDK-Aktivität am Beispiel der CDK2. Der angegebene CDK/Cyclin-Komplex liegt in aktiver Form vor. Pfeile, die von der zentralen Darstellung des Komplexes wegführen, zeigen eine Inaktivierung an. Pfeile, die zum Komplex hindeuten, beschreiben Aktivierungsschritte.

2.3.1 Aufbau einer CDK

Im Prinzip findet man bei den CDK die gleiche Faltung wie bei anderen eukaryontischen Proteinkinasen (z.B. PKA),30 ebenfalls allgemein konserviert sind katalytische Reste, die man in der aktiven Spalte der CDK findet.14,17

Den folgenden Ausführungen zur Struktur der CDK liegen Untersuchungen an Kristallen von CDK2 zugrunde. Die Angaben einzelner Aminosäuren und deren Position kann deshalb bei anderen CDK variieren. Da in der Familie der CDK aber eine hohe Homologie zu finden ist, ist eine Vergleichbarkeit der dreidimensionalen Strukturen wahrscheinlich.17 Beispielsweise ist CDK5 zu 73 % identisch mit CDK1 und zu 75 % mit CDK2.11

Die katalytische Einheit der CDK beinhaltet ca. 300 Aminosäuren.13,14 Sie lässt sich einteilen in eine N-terminalen Domäne (Aminosäuren 1-85), die zum größten Teil aus β-Faltblatt-Strukturen besteht, und eine größere, C-terminale Domäne, die wiederum reich an α-Helices ist.14,30 (Siehe Bild 2-3.)

Eine tiefe Spalte an der Verbindung der beiden Domänen bildet die katalytische Region mit der ATP-Bindungsstelle. Die Verbindung zwischen beiden Domänen ist einem Scharnier ähnlich, besteht nur aus wenigen Aminosäuren und wird Hinge-Region genannt (hinge: engl. Türangel, Scharnier).

Ein typisches Merkmal der CDK ist das Vorhandensein einer streng konservierten Sequenz im Bereich der N-terminalen Domäne, die PSTAIRE genannt wird (Aminosäuren 45-51). Diese Region gehört zur einzigen α-Helix (α1-Helix) der N-terminalen Domäne, welche die Aminosäuren 44-58 beinhaltet,13-15,17,30 und ist an der Bindung zum Cyclin beteiligt.

In der inaktiven, monomeren Form der CDK wird der Zugang zur katalytischen Spalte durch eine Schleife blockiert, die man T-Schleife nennt (Aminosäuren 146-170 nach D.O. Morgan15, Aminosäuren 146-166 nach P.D. Jeffrey14). Die T-Schleife ist im Bild 2-3 sowie in Bild 2-4 und Bild 2-5 blau eingefärbt. In dieser Schleife ist das Thr160 zu finden, dessen Phosphorylierung zu einer drastischen Aktivitätssteigerung der CDK2 führt (Thr161 bei CDK1, Thr172 bei CDK4). Ein weiterer Grund für die Inaktivität der monomeren CDK ist, dass ohne Cyclin-Assoziation die Orientierung der ATP-Phosphatkette eine Phosphatabspaltung und Übertragung der Phosphatgruppe auf ein Substrat nicht erlaubt.15

Bild 2-3
Bild 2-3: CDK2 mit gebundenem ATP. In der Darstellung sind α helicale Bereiche durch rote Spiralen, β-Faltblattstrukturen als gelbe Bänder und die verbindenden Strukturen in cyan dargestellt. Die T-Schleife wurde blau eingefärbt (AS 146-170) und ATP ist in „Kugel und Stab-Darstellung“ zu sehen. Wegen der hohen Flexibilität fehlen Aminosäuren 37-40 im Anschluss an die PSTAIRE-Helix. Die Koordinaten wurden aus der Brookhaven-Proteindatenbank31 übernommen (PDB ID: 1HCK32) und mit SYBYL33 dargestellt.

2.3.2 Positive regulatorische Mechanismen, Aktivierung

An CDK2/Cyclin A-Kristallen wurden die konformativen Änderungen der CDK-Struktur durch eine Komplexbildung mit Cyclin A untersucht (siehe Bild 2-4). Die Cyclin-Box von Cyclin A bindet an die PSTAIRE-Helix der CDK2 mit Wechselwirkungen zu den beiden Domänen des aktiven Zentrums.14,30 Die dadurch angestoßene Umkonfigurierung der CDK hat zur Folge, dass inhibitorische Teile aus dem katalytischen Zentrum entfernt werden und regulatorische Bereiche einer Phosphorylierung zugänglich gemacht werden. Die T-Schleife wird aus dem Eingangsbereich der katalytischen Spalte entfernt und dem umgebenden Lösungsmittel ausgesetzt. Durch die Cyclin-Bindung wird außerdem die aktive Spalte aufgeweitet, die PSTAIRE-Helix in das katalytische Zentrum geschoben und dabei gedreht. Dadurch wird das für eukaryontische Proteinkinasen typische Glu51 der PSTAIRE-Region in eine Position gebracht, die es ihm erlaubt, die Phosphatreste des ATPs zusammen mit Lys33, Asp145 und einem Magnesiumion neu zu koordinieren und sie in die richtige Stellung für eine Phosphatübertragung zu bringen.13-15,30

Durch die Änderungen liegt jetzt auch das Thr160, welches zur T-Schleife gehört, frei, so dass es von anderen Kinasen phosphoryliert werden kann. Die Cyclin A-Bindung allein steigert die Aktivität von CDK2 um mehrere Größenordnungen, aber die Phosphorylierung bewirkt eine entscheidende Aktivitätssteigerung um das 80-300fache.14,15,22 Der Aufbau der katalytischen Spalte wird durch die Phosphorylierung nicht sehr stark verändert, das Phosphat an Thr160 hat vielmehr Einfluss auf ein Netz von Wasserstoffbrückenbindungen. Es wird angenommen, dass das Thr160-Phosphat dadurch einerseits die CDK/Cyclin-Bindung zur nötigen Festigkeit führt und zum anderen die CDK/Cyclin-Substrat-Bindung begünstigt.15,17 Die Proteinkinase, die die Phosphorylierung am Thr160 der CDK2 ausführt, ist ebenfalls eine CDK, nämlich CDK7, die außerdem noch an der Transkription beteiligt ist. Diese CDK7 entfaltet ihre Aktivität entweder nach Assoziation mit Cyclin H und Phosphorylierung oder nach Assoziation mit Cyclin H und einer dritten Untereinheit, MAT1. Der letztgenannte Komplex ist in dieser Zusammensetzung ungewöhnlicherweise aktiv, ohne selbst an einem Rest phosphoryliert zu werden, der dem Thr160 der CDK2 entspricht.13,15,17 Die Aktivität der CDK7 ist in den verschiedenen Zellzyklusphasen relativ konstant, während die Konzentrationen der Cycline im Verlauf des Zellzyklus starken Schwankungen unterliegen. Die Steigerung der CDK-Aktivität an bestimmten Punkten des Zellzyklus wird deshalb eher durch Cycline gesteuert, als durch CDK7/Cyclin H/MAT1.13,15 CDK4/Cyclin D wird am Thr172 ebenfalls phosphoryliert, bevor es an der Einleitung der S-Phase mitwirkt.13 Für CDK1/Cyclin B stellt die Phosphorylierung am entsprechenden Thr161 einen noch wichtigeren Faktor für die Ausbildung der Aktivität dar, während CDK5/p35 und CDK8/Cyclin C sowie CDK7/Cyclin D/MAT1 keiner Phosphorylierung bedürfen. CDK8 besitzt noch nicht einmal eine Phosphorylierungsstelle in der T-Schleife.15

Die Aktivierung durch Dephosphorylierung an Thr14 und Tyr15 erfolgt durch cdc25-Phosphatasen. Für CDK1/Cyclin B ist ein vorheriger Transport in den Nukleus wichtig.34 (Siehe Kapitel 2.5.2.)

Bild 2-4
Bild 2-4: CDK2/Cyclin A-Komplex mit ATP, phosphoryliert an Thr160 (Phosphat an Thr160 nicht abgebildet). Die Farbgebung der CDK2-Strukturen entspricht Bild 2-3. Cyclin A*14,35 (rechts) ist karamellfarben eingefärbt. Die Koordinaten wurden aus der Brookhaven-Proteindatenbank31 übernommen (PDB ID: 1JST36) und mit SYBYL33 dargestellt.

2.3.3 Negative regulatorische Mechanismen, Inaktivierung

Der aktivierenden Phosphorylierung am Thr160 der CDK2 stehen inaktivierende Phosphorylierungen an Thr14 und Tyr15 gegenüber. Diese beiden Angriffspunkte liegen nach der Konformationsänderung der CDK2 durch Cyclin A-Anlagerung frei und können durch die Kinasen Myt1 (v.a. Thr14, weniger auch Tyr15) und Wee1 (Tyr15) phosphoryliert werden. Eine Abspaltung dieser hemmenden Phosphatreste wird durch cdc25-Proteinphosphatasen durchgeführt, so dass die Aktivität des CDK/Cyclin-Komplexes durch Anbringen oder Entfernen von verschiedenen Phosphatresten sowohl positiv als auch negativ beeinflusst werden kann.27

Zur weiteren Regulation der CDK-Aktivität existieren relativ kleine, inhibitorische Proteine, die zwei verschiedenen Proteinfamilien angehören. Zum einen gibt es die INK4-Familie (CDK4-Inhibitoren) und zum anderen die CIP- bzw. KIP-Familie (CDK2 Interacting Proteins; Kinase Inhibiting Proteins).37

Zur INK4-Familie werden zur Zeit vier Mitglieder gerechnet: das p15INK4B, p16INK4A, p18INK4C und p19INK4D (im folgenden Text als p15, p16, p18 und p19 bezeichnet). Die INK4-Proteine gelten als spezifisch für die G1-Phase des Zellzyklus und inhibieren hier CDK4 und CDK6, indem sie an die freie CDK binden und mit den Cyclinen (D1-3) kompetieren.12,18,30,38 p16 bindet zwar nicht an die Cyclin-Bindungsstelle, verdreht aber bei seiner Anlagerung an die CDK die beiden Domänen des Enzyms, so dass auch die Cyclin-Bindungsstelle verändert wird. Ebenfalls von der Inhibition betroffen ist die ATP-Bindungsstelle, die durch p16-Annäherung verdreht wird, wodurch die Bindungsfähigkeit von ATP beeinträchtigt wird. Da die Affinität von p16 zur CDK höher ist als die des Cyclins zur CDK, wird die aktivierende Cyclin-Anlagerung verhindert. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die INK4-Familie auch bereits assoziierte CDK/Cyclin-Komplexe hemmen kann.30

Zur CIP-Gruppe werden bisher drei verschiedene Proteine gezählt: p21CIP1, p27KIP1 und p57KIP2 (im folgenden Text als p21, p27 und p57 bezeichnet), die eine breitere inhibitorische Aktivität aufweisen. CIP-Proteine hemmen vor allem CDK2/Cyclin-Komplexe und sind deshalb an der G1- und G1/S-Kontrolle beteiligt.30 Die Inhibition verläuft hierbei über Wechselwirkungen mit CDK und Cyclin, indem das CIP-Protein sich wie eine Klammer über den Enzymkomplex legt (siehe Bild 2 5). Durch Untersuchungen von Kristallen aus CDK2/Cyclin A/p27 konnten strukturelle Veränderungen genauer festgestellt werden. Einerseits wird die Form der katalytischen Spalte verändert, andererseits legt sich ein Teil des Inhibitors so in die ATP-Bindungsstelle, dass eine Einlagerung von ATP nachgeahmt wird.13,15,22,30

Bild 2-5
Bild 2-5: CDK2/Cyclin A/p27-Komplex, phosphoryliert an Thr160 (Phosphat nicht abgebildet). Cyclin A (AS 173-432, siehe Bild 2-4) (rechts) ist karamellfarben eingefärbt, der Inhibitor p27 erscheint magentafarben. Die Farbgebung der CDK2-Strukturen entspricht Bild 2-3. Die Koordinaten wurden aus der Brookhaven-Proteindatenbank31 übernommen (PDB ID: 1JSU39) und mit SYBYL33 dargestellt.

Interessanterweise wurde für p21 und p27 beobachtet, dass sie die Assoziation von CDK4 und Cyclin D fördern, während sie auf andere CDK hemmend wirken.12,15 Auf welche Weise und ob p27 inhibierende oder aktivierende Eigenschaften ausübt, wird von p16 moduliert, welches p27 von CDK4 verdrängen und freisetzen kann, so dass p27 CDK2/Cyclin E hemmen kann. Als Folge beobachtet man dann eine Blockade des Zellzyklus in der G1-Phase.16 Zu den IC50-Werten einiger natürlicher CDK-Inhibitoren siehe auch Tabelle 3-1.