2.4 Substrate der CDK im Zellzyklus

CDK phosphorylieren verschiedene Substrate an Threonin- oder Serin-Resten.26 Da Substrate der CDK schwierig zu finden sind, liegen nur über einige von ihnen genauere Angaben vor.13 Mögliche Zielsubstanzen für eine CDK-Phosphorylierung findet man unter den Tumorsuppressoren bzw. Transkriptionsfaktoren und Replikationsfaktoren. Auch organisatorische Faktoren, die Chromatinstrukturen* und den strukturellen Aufbau der Zelle beeinflussen, gehören zu den Substraten der Cyclin-abhängigen Kinasen.26

Retinoblastoma-Protein (pRb)/Transkriptionsfaktor E2F

Zu den am besten untersuchten Substraten einer CDK gehört der Tumorsuppressor pRb (Retinoblastoma-Protein**), welcher eine zentrale Rolle in der Verarbeitung externer Signale spielt. pRb besitzt vielfältige Serin- bzw. Threonin-Phosphorylierungsstellen, die v.a. durch CDK4/Cyclin D, CDK6/Cyclin D oder CDK2/Cyclin E phosphoryliert werden können. Verschiedene CDK bevorzugen hierbei unterschiedliche Phosphorylierungsstellen.12 Bei Durchführung von in vitro Tests wurde festgestellt, dass CDK4/Cyclin D oder CDK6/Cyclin D selektiv pRb phosphorylieren. Andere getestete Substrate wurden nicht verändert.26 Am Retinoblastoma-Protein findet man auch noch Bindungsstellen, z.B. für DNS, virale Onkoproteine und für E2F.

E2F ist ein Transkriptionsfaktor, welcher durch Bindung an pRb inaktiviert wird. Die Freisetzung von E2F hängt vom Phosphorylierungsstatus des pRb ab: Hypophosphoryliertes pRb bindet E2F und wirkt deshalb wachstumshemmend, während hyperphosphoryliertes pRb den Transkriptionsfaktor E2F freisetzt und dadurch das Zellwachstum fördert. Mit pRb verwandt sind die Proteine p107 und p130, welche ebenfalls von den CDK der G1-Phase, CDK4/Cyclin D und CDK6/Cyclin D, phosphoryliert werden. Über ihre Funktion ist wenig bekannt.12,13,17,38

Zur E2F-Gruppe zählt man bisher sechs Mitglieder (E2F1 bis E2F6), von denen auf jeden Fall E2F1-3 direkt von pRb kontrolliert werden. Wird E2F wie oben beschrieben freigesetzt, so bindet es an die DNS und aktiviert die Transkription von Genen, die im Zellzyklus für den G1/S-Übergang und die S-Phase wichtig sind. Dazu gehören Gene für E2F selbst, Dihydrofolatreduktase, Thymidinkinase, CDK1, Cyclin E und Cyclin A.13,17,18 In einigen Zelltypen ist E2F zusätzlich an DP1 (DNS-Bindungsprotein) gebunden. Wird E2F/DP1 durch CDK2/Cyclin A gebunden und die Untereinheit DP1 phosphoryliert, so wird die Bindungsfähigkeit an die DNS herabgesetzt. Dies führt zu einer Hemmung der transkriptionsfördernden Eigenschaften und gehört zu den zellulären Kontrollelementen der S-Phase.13
Der Einfluss der CDK auf die Transkription durch Phosphorylierung der RNS Polymerase II wurde in Kapitel 2.2.2 erläutert.

Protein p53

Ebenfalls zu den Tumorsuppressoren gehört das Protein p53, ein Transkriptionsaktivator, der z.B. bei DNS-Schäden den zur CIP-Familie gehörenden CDK-Inhibitor p21 induziert oder zur Expression des Cyclin G-Gens führt. Als Teil eines Kontrollmechanismus kann p53 bei Zellschäden den Zellzyklus z.B. am G1/S-Übergang stoppen.13 Eine Akkumulierung von p53 wurde bei zellulärem Stress (z.B. durch ionisierende Strahlen oder chemische Substanzen) beobachtet und kann zu Stillstand des Zellzyklus oder Apoptose führen.27

In der Zelle liegt p53 vermutlich als inaktiver Pool vor, aus dem es durch posttranslationale Mechanismen aktiviert werden kann. Es wird angenommen, dass die Bindungsfähigkeit an die DNS durch einzelsträngige DNS gesteigert wird. Außerdem wird vermutet, dass eine Aktivitätssteigerung von p53 durch Phosphorylierung erreicht wird. Eine Phosphorylierung durch die S- und G2/M-Phasen-CDK wurde sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet. Eine zusätzliche Regulation der p53-Aktivität erfolgt durch Hemmung des Ubiquitin-abhängigen Abbaus des p53-Proteins.13,27,38

Verschiedene Substrate

Schließlich sollen noch die Substrate erwähnt werden, die in der M-Phase vor allem von CDK1/Cyclin B phosphoryliert werden. Dies sind größtenteils Proteine, die zur Reorganisation des Cytoskeletts, der Kernmembran und der Spindelausbildung nötig oder für den vesikulären Transport verantwortlich sind. Eine spezifische Phosphorylierung während des Zellzyklus findet z.B. bei Laminen und Myosin statt.13 Lamine sind Proteine, die den Hauptbestandteil der Kernmembran darstellen.41 Das Myosin bildet den Hauptbestandteil des Muskelgewebes (60-70 %) und kommt praktisch in allen Wirbeltier-Zellen vor. Neben seinen strukturgebenden Aufgaben besitzt Myosin eine ATPase-Funktion. Diese überführt ATP (Adenosintriphosphat) unter Abspaltung von Phosphat in ADP (Adenosindiphosphat), wodurch Energie für die Muskelbewegung geliefert wird.10

Die Phosphatübertragung durch CDK auf den Transkriptionsfaktor TFIIIB führt zur Inhibition der RNS Polymerase III-Transkription. Um während der Mitose eine Cyclin B- und Cyclin A-Proteolyse, einen Übergang in die Anaphase und den Abschluss der Mitose zu erreichen, muss der Anaphase Promoting Complex (APC) durch CDK1/Cyclin B phosphoryliert werden.13 Als weitere Substrate von CDK werden MAP4 (Microtubule-Associated Protein 4)21 und Histon H1 erwähnt.13,17 Histone sind Proteine mit vielen basischen Aminosäuren, die in der Lage sind, die DNS effektiv zu binden. Die dadurch erreichbare hohe Packungsdichte der DNS-Moleküle ermöglicht deren Unterbringung im Zellkern. Werden Histone phosphoryliert, erhöht sich die negative Ladung der Histon-Moleküle, wodurch es zu einer Abnahme der Wechselwirkungen zwischen DNS und Histon kommt. Die daraus resultierende Freisetzung der DNS aus der Histon-Bindung ist eine entscheidende Voraussetzung für die Einleitung der Transkription, welche durch eine enge Bindung der DNS an das Histon-Protein räumlich blockiert wird.40

Durch mehrere Mechanismen kommt es zur Verstärkung der CDK1/Cyclin B-Aktivität mittels positiver Rückkopplung. Einerseits kann die Wee1-Kinase, welche CDK1/Cyclin B durch Phosphorylierung inaktiviert, umgekehrt durch aktive CDK1/Cyclin B phosphoryliert und damit selbst inaktiviert werden. Andererseits wird die CDK-aktivierende cdc25-Phosphatase durch Phosphorylierung mittels CDK1/Cyclin B in ihrer Aktivität gefördert.15

* Die DNS ist im Zellkern mit Proteinen und kleineren Mengen RNS assoziiert. Die Gesamtheit dieses Komplexes wird als Chromatin bezeichnet. Während der G1-, G2- und S-Phase erscheint es eher unstrukturiert. Besonders kompakt und durch Kondensation strukturiert liegt das Chromatin nur während der Mitose in Form von Chromosomen vor.40
** Das Retinoblastoma-Protein wurde nach einem seltenen Augentumor, dem Retinoblastom, benannt, in welchem es grundsätzlich mutiert vorkommt.26